Tel：13770851495
一、什么是细胞稳转株
细胞稳转株即稳定表达的细胞株，指基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。稳定转染的细胞株，是转染后质粒可以稳定整合到基因组上，不会因细胞分裂而丢失，区别于质粒瞬时转染不能长时间保留质粒在细胞里。就是把质粒或者慢病毒形式整合到细胞基因组上，用相应的质粒或慢病毒中抗性基因来筛选该细胞系，就成了稳定表达的细胞系。稳转株即稳定表达的细胞株，指基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。例如，在生物学和医学研究中，稳定表达细胞株被广泛应用于基因功能研究、药物筛选和疾病模型建立等领域。
二、为什么要建立细胞稳转株
细胞稳转株的建立具有多方面的重要意义。
降低频繁转染或病毒包装成本，方便研究基因功能实验。
通过建立稳转细胞系，可以避免频繁进行转染或病毒包装操作，从而降低实验成本。这使得在目的细胞中进行基因功能实验研究更加便捷和经济高效。例如，在长期的实验研究中，不必反复进行转染，节省了时间和资源。
实现更好的基因干扰效果，区别于瞬时转染无法去除已表达目的蛋白。
与瞬时转染不同，稳定细胞株不仅能够干扰表达，还能更好地去除已表达的目的蛋白。对于部分蛋白半衰期极长的情况，瞬时 RNA 只能干扰表达，无法有效去除已表达的目的蛋白。而构建稳转细胞系可以实现更好的基因干扰效果，为研究提供更准确的实验结果。
避免瞬转引入极高拷贝数表达造成实验结果不精确，可筛选拷贝数适量细胞。
瞬转会引入极高拷贝数的表达，这可能因人为因素造成实验结果的不精确。建立稳转细胞系可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究，降低人为因素的干扰，提高实验的准确性和可靠性。
满足诱导表达系统需求，如致死基因或时空表达。
对于需要用诱导表达系统的实验，主要是一些致死基因或者需要时空表达的情况，建立稳转细胞株是理想的选择。例如，在一些特定的基因功能研究中，需要对基因的表达进行精确的时空控制，稳转细胞株可以满足这种需求。
三、细胞稳转株构建原理
细胞稳转株的构建主要是通过将外源 DNA/shRNA 克隆到带有抗性基因的载体上，然后将重组载体转染至宿主细胞并使其整合到染色体中，最后用载体中所含的抗性基因进行筛选。
具体而言，首先通过将外源 DNA/shRNA 克隆到带有某种抗性基因的载体上，例如常用的真核表达载体抗性筛选标志物有嘌呤霉素（puromycin）、新霉素（neomycin）和杀稻瘟菌素（blasticidin）等。重组载体转染至宿主细胞后，会整合到宿主细胞的染色体中，并随细胞分裂稳定传递。这样，在后续的筛选过程中，就可以利用载体中所含的抗性基因进行筛选，从而得到稳定表达外源基因的细胞株。
例如在慢病毒介导的稳转株筛选中，实验原理就是通过将外源 DNA/shRNA 克隆到带有某种抗性基因的载体上，重组载体转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并随细胞分裂稳定传递，最后用载体中所含抗性基因进行筛选。抗性选择常用嘌呤霉素、新霉素和杀稻瘟菌素等。
在准备及预实验阶段，需要进行慢病毒感染 MOI 摸索及抗性浓度摸索。对于 Puromycin 工作浓度筛选预实验，大部分细胞 puromycin 的工作浓度为 1~10μg/ml，可以在《慢病毒感染手册》上查阅 Puromycin 目的细胞中筛选的致死筛选参考用量。若未在附件中找到使用的细胞，在正式实验前，先进行 Puromycin 梯度筛选预实验，确定能在 2 天杀死野生型细胞的最低 Puromycin 浓度。
在稳定株筛选阶段，慢病毒感染 48 - 72h 后，将细胞继续培养于含适当浓度 Puromycin 的培养液中。经过筛选，当空细胞加 puro 组全部死亡时，认为感染病毒组剩下的全部是阳性细胞。此时可以进行混合克隆稳转株的构建或单克隆稳转株的构建。
对于混合克隆稳转株的构建，首先进行目的细胞病毒感染，将处于对数生长期的细胞胰酶消化，制成细胞悬液并接种到培养板中，加入最适病毒量进行感染，感染后更换为常规培养基继续培养。然后在感染后细胞中加入抗生素筛选，筛选至少 48h，待荧光效率达到 100% 后，降低抗生素维持浓度继续对感染后的细胞进行筛选和扩增，同时进行下游 qPCR 检测。最后进行细胞扩增、冻存和复检。
对于单克隆稳转株的构建，对感染并筛选后的混合克隆稳转株细胞进行稀释培养，挑取单一细胞生长而成的细胞克隆，再进行扩大培养。可以将细胞消化后接种于 96 孔板中，接种的细胞密度为 1 个 / 孔，通过有限稀释的方法或流式分选标记出具有单个细胞的孔，等细胞扩增后用 puro 进行筛选，筛选完毕后进行 qPCR 或 Western Blot 鉴定，选择鉴定结果正常的单克隆细胞冻存保种。
四、常用构建方法
目前常用脂质体转染和病毒转染，病毒有慢病毒、腺病毒、逆转录病毒。
病毒转染是构建细胞稳转株的常用方法之一。慢病毒因其能感染大多数分裂细胞和非分裂细胞，且包装技术成熟，成为稳转细胞系构建的首选系统。慢病毒载体通常是在 293T 细胞中进行三质粒共转染后获得，包括包装质粒、包膜质粒和转移质粒。其中包装质粒提供结构和 RT 蛋白，包膜质粒编码糖蛋白假型化载体颗粒，转移质粒包含用于复制 / 转录和包装的顺式作用序列以及启动子，促使目的基因以细胞类型特异性或非特异性方式表达。
慢病毒感染目的细胞后，可将外源基因有效地整合到宿主染色体上，实现稳定表达。构建稳转细胞株时，首先要确定最适慢病毒感染复数（MOI），可通过查阅文献或设计梯度实验摸索。其次确定目的细胞药物筛选浓度，不同细胞对同种抗生素及同种细胞对不同抗生素的最佳使用浓度不同。然后进行慢病毒感染目的细胞，一般在感染 24h 后开始用抗生素筛选稳转株，抗生素表达阳性细胞死亡后需及时换液。最后对稳转细胞株进行检测，包括 mRNA 水平检测（如 qRT-PCR 法）以及蛋白水平检测（如 Western blot 或细胞免疫荧光技术），检测合格后对细胞系进行扩大培养与冻存。
除了慢病毒转染，腺病毒和逆转录病毒也可用于细胞稳转株的构建。腺病毒具有感染效率高、感染谱广等特点，但可能存在包装容量限制等问题。逆转录病毒同样可以将外源基因整合到宿主细胞基因组中，但在使用过程中也需要考虑其稳定性和安全性等因素。
此外，还有一种利用转座子系统进行细胞稳转株构建和筛选的技术，即 VIRUS-Free?技术。该技术在载体中包括了转座子的识别区域，在转座酶的催化下，将目的片段从载体上或者 BAC 分子上切割下来形成一个小环结构，并在基因组里面的固定序列位置进行插入，从而实现稳转。目前已经在 CAR-T 细胞治疗中得到较多的临床应用，具有低成本、高效率、基因表达稳定的特点。
五、影响稳转株建立的因素
1. 外源基因的整合率决定筛选难易程度
外源基因的整合率在很大程度上决定了稳转株筛选的难易程度。如果整合率高，那么筛选稳转株相对容易；反之，整合率低则会使筛选过程变得困难。例如，在一些研究中，由于外源基因整合率较低，研究人员需要进行大量的筛选工作才能获得稳定表达的细胞株。
2. 插入外源基因片段的拷贝数，低拷贝或单拷贝可降低人为干扰
插入外源基因片段的拷贝数对稳转株的建立也有着重要影响。通常情况下，低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰。这是因为高拷贝数可能会导致过度表达或其他不可预测的影响，而低拷贝或单拷贝更接近自然状态，能够减少人为因素对实验结果的干扰。
3. 整合位点的转录活跃度影响表达质量
整合位点的转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量。如果整合位点的转录活跃度高，那么外源基因片段的表达量可能会更高，表达质量也可能更好。相反，如果整合位点的转录活跃度低，外源基因的表达可能会受到限制，影响稳转株的质量。
4. 外源基因片段整合到细胞后的稳定性决定是否易丢失
外源基因片段整合到细胞后的稳定性是影响稳转株建立的另一个关键因素。不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象。为了确保稳转株的稳定性，研究人员需要选择合适的整合位点，并采取相应的措施来提高外源基因的稳定性。
六、稳转株建立步骤
（一）病毒法
确定目标细胞系相关信息，包括培养条件、增值速度、支原体污染情况。这一步骤至关重要，因为不同的细胞系在培养要求上存在差异，了解这些信息有助于后续实验的顺利进行。例如，某些细胞可能需要特定的培养基成分、特定的温度和二氧化碳浓度等条件才能良好生长。同时，支原体污染会对细胞的生长和实验结果产生不良影响，因此需要提前检测和排除。
预实验确定 MOI 值，通过查阅文献或设计梯度实验摸索最适 MOI。MOI（感染复数）的确定对于病毒感染的效率至关重要。可以通过查阅已有的文献资料，了解目标细胞系通常使用的慢病毒 MOI 值范围，然后在此基础上设计梯度实验，逐步调整病毒的用量，观察细胞的感染情况，以确定最适合该细胞系的 MOI 值。
预实验确定筛选药物用量，常用 puro、G418、潮霉素等。不同的细胞对筛选药物的敏感性不同，因此需要通过预实验确定合适的药物用量。例如，对于大部分细胞，puromycin 的工作浓度为 1~10μg/ml，可以在《慢病毒感染手册》上查阅 Puromycin 目的细胞中筛选的致死筛选参考用量。若未找到使用的细胞，可先进行 Puromycin 梯度筛选预实验，确定能在 2 天杀死野生型细胞的最低 Puromycin 浓度。
细胞铺板，接种适量细胞于培养皿。根据实验要求和细胞的生长特性，将适量的细胞接种到培养皿中，确保细胞在合适的密度下生长，为后续的病毒感染做好准备。
细胞感染，根据细胞量和 MOI 计算添加病毒体积。在确定了 MOI 值和细胞量后，可以计算出需要添加的病毒体积。将病毒准确地加入到细胞培养体系中，进行感染操作。
撤病毒，第二天换液。感染后的第二天，一般不超过 24h 进行换液操作，以去除未感染的病毒和细胞代谢产物，为细胞的生长提供新鲜的环境。
转染 48h 后用抗性药物筛选。在转染 48 小时后，加入筛选药物，如 puromycin、G418 或潮霉素等，对感染后的细胞进行筛选。只有成功整合了外源基因并表达抗性基因的细胞才能在筛选药物的作用下存活下来。
筛选结束后进行单克隆化，选择阳性克隆培养。筛选结束后，对存活下来的细胞进行单克隆化操作，挑取单一细胞生长而成的细胞克隆，再进行扩大培养。可以将细胞消化后接种于 96 孔板中，通过有限稀释的方法或流式分选标记出具有单个细胞的孔，等细胞扩增后用 puro 进行筛选，筛选完毕后进行 qPCR 或 Western Blot 鉴定，选择鉴定结果正常的单克隆细胞冻存保种。
（二）VIRUS-Free?技术
确定目标细胞系相关信息，包括培养条件、增值速度、支原体污染情况。与病毒法相同，首先需要了解目标细胞系的基本信息，为后续实验提供基础。
预实验确定 MOI 值，通过查阅文献或设计梯度实验摸索最适 MOI。虽然 VIRUS-Free?技术与病毒法有所不同，但 MOI 值的确定仍然是重要的步骤，可以通过类似的方法进行摸索。
预实验确定筛选药物用量，常用 puro、G418、潮霉素等。同样，筛选药物用量的确定对于 VIRUS-Free?技术也很关键。
细胞铺板，接种适量细胞于培养皿。这一步骤与病毒法一致，确保细胞在合适的环境中生长。
细胞感染，根据细胞量和 MOI 计算添加病毒体积。在 VIRUS-Free?技术中，虽然不是传统的病毒感染，但可能也需要根据细胞量和特定的参数来确定添加的试剂体积。
撤病毒，第二天换液。与病毒法类似，及时换液为细胞提供良好的生长环境。
转染 48h 后用抗性药物筛选。在适当的时间后，使用抗性药物进行筛选，以获得阳性克隆。
筛选结束后进行单克隆化，选择阳性克隆培养。最后，进行单克隆化操作，挑选出阳性克隆进行培养。
VIRUS-Free?技术利用转座子系统，在转座酶催化下将目的片段切割成小环结构插入基因组固定序列位置实现稳转。该技术具有以下优势：
序列完整性好，如果小环的结构被破坏则无法实现基因组插入。这保证了插入的目的片段的完整性，有利于目的基因的准确表达。
可插入大片段，可以实现上百 Kb 的 BAC 片段的插入，而且能够保证其序列完整性，可以进行复杂的基因功能研究。对于一些需要插入大片段基因的研究，VIRUS-Free?技术具有明显的优势。
目的插入效率高，由于通过酶促反应，所以整个反应的过程效率远远高于 DNA 随机插入效率。酶促反应的高效性使得目的基因能够更快速、准确地插入到基因组中。
目的基因表达稳定，由于细胞插入的拷贝数相对于病毒来说比较稳定，在稳转株的构建过程中，细胞的表达更加稳定。稳定的表达有助于获得可靠的实验结果。
实验时间只需要慢病毒系统时间一半，实验更加安全。缩短实验时间可以提高研究效率，同时减少实验过程中的风险。
可以实现：稳转之后对目的克隆进行检测后可以再将目的基因在原克隆移除，轻松实现加减法的对照。这为实验设计提供了更多的灵活性和可操作性。
七、稳转株构建中的常见问题
支原体污染问题，轻度污染易在病毒感染后爆发，导致筛选失败，构建之初需排除支原体污染。
在细胞稳转株构建过程中，支原体污染是一个需要高度重视的问题。支原体是一种缺乏细胞壁的原核微生物，直径小，可透过一般滤膜，在细胞培养过程中极易造成污染。已有研究显示，世界范围内正在使用的细胞体系中支原体污染发生率达到 30% - 60%。中国医学科学院基础医学研究所检测过的国内来源的细胞株系，支原体污染率高达 60%。支原体感染初期，培养液清澈不浑浊，但 pH 值变化明显，培养液更换后几小时内变为酸性（颜色变黄）；高倍镜下观察细胞外形无明显变化但有细小黑色颗粒，不容易被发现。虽然支原体可以与细胞长期共存，且随着细胞换液而缓解，但细胞遭受支原体污染后会抑制细胞生长，改变细胞的 DNA/RNA 及蛋白表达，使细胞的转染效率大大降低，并在污染后期引起细胞变形，对后续教学、科研产生严重影响。因此，在构建细胞稳转株之初，必须排除支原体污染。例如，可以通过保持操作环境清洁、对实验用品进行无菌处理、操作者遵守无菌室消毒规定、严格按照无菌操作要求以及定期进行支原体污染检测等方法来预防支原体污染。
其他问题如病毒对某些细胞不适用、基因过表达稳定性极限、安全性和成本高、MOI 优化和储存活性问题等。
除了支原体污染问题，细胞稳转株构建中还存在其他一些常见问题。例如，病毒对某些细胞不适用，很多悬浮细胞对病毒转染效果不佳，或者操作困难，如 K562、U937 等血液和悬浮细胞系；还有对病毒极度敏感的细胞，会导致细胞死亡，如 BV2、神经元等神经系统的细胞系。此外，病毒法对于基因过表达存在稳定性极限，由于基因是通过病毒载体随机插入到目的细胞的基因组中，拷贝数不稳定且分布不均匀，在后续的细胞传代中，拷贝数会不断稀释，导致 “基因表达量” 逐步下降，特别是在传代超过 15 代之后，此时加药物也不一定能够稳定表达。病毒法的安全性和成本也较高，操作过程成本一般需要几千元的病毒包装费用，而且都需要 2 - 3 周的时间；同时由于病毒的 HIV 改造特征，对人体的表皮细胞也有一定的感染性，所以需要在生物安全二级实验室操作。另外，病毒的 MOI 优化和储存活性也存在问题，不同批次的 MOI 有差异，每次实验都需要对病毒的 MOI 进行测试并获得最优的 MOI 数据，费事费力；其次，病毒在 -80 度，超过 2 周就可以检测到滴度的下降。
