慢腺病毒细胞株构建

技术原理

慢病毒包装：使用3质粒慢病毒包装系统，慢病毒系统使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中，培养48h后，收集上清。纯化后留取部分检测病毒滴度，其余病毒冻存于-80℃冰箱中。

滴度检测：将病毒颗粒使用梯度稀释，分别感染293T细胞，感染72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。

细胞感染：在病毒感染前一天对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无血清培养基稀释病毒，加入12孔板中对细胞进行感染，病毒数量根据推荐细胞的感染MOI加入（若无推荐MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,1005个梯度对细胞感染），感染6h后去除含病毒溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量PCR和Westernblot检测目的基因的稳定表达情况。

实验方法

技术总结：

1、MOI（multiplicityofinfectin），感染复数，含义为感染时病毒和细胞数量的比值。多数细胞查阅文献也能获得推荐的MOI，但不同实验室，不同病毒测算出的MOI也有差别。所以建议根据自己包装的慢病毒重新检测MOI。

2、为了能获得最佳效果的单克隆稳定细胞株，可以增大筛选的总量。

慢腺病毒细胞株构建流程复杂，各环节均需严谨操作以保障成功率。载体构建时，目的基因序列需反复校对，避免移码突变；连接载体与目的片段后，通过菌落 PCR、测序验证插入方向和完整性，防止假阳性克隆。

病毒包装阶段，293T 等包装细胞需处于对数生长期，确保高转染效率；转染试剂与质粒比例要精准优化，减少细胞毒性。收集病毒上清时，需多次低速离心去除细胞碎片，并及时进行病毒浓缩与纯化，避免病毒滴度随时间降低。

细胞感染过程中，需预实验摸索最佳 MOI 值，防止感染过度导致细胞死亡或感染不足影响效率；同时设置阴性对照（未感染细胞）与阳性对照（空载病毒感染细胞），排除背景干扰。感染后需借助嘌呤霉素等抗生素筛选稳定细胞株，定期检测目的基因表达水平，避免基因沉默或丢失，确保细胞株质量稳定可靠。