细胞克隆实验

应用简介

克隆形成及细胞克隆接种存活率，通过观察单细胞集落形成情况，来计算克隆形成率，了解其增殖能力。

技术原理

单个细胞在体外持续增殖6代以上时细胞数量已达60个左右，此细胞群体成为克隆或集落，大小在1.0-2.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力，各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖率和对生存环境的适应性。软琼脂培养或平板克隆是最常用的方法。

实验方法

技术总结

1、试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

2、细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响。

3、克隆形成率公式：克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。

4、一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

细胞克隆实验旨在获得遗传均一的细胞群体，操作时需从多个环节严格把控。接种前，细胞需处于对数生长期且状态良好，避免使用传代次数过多、老化的细胞；调整细胞密度至关重要，一般采用有限稀释法，将细胞稀释至合适浓度（如每孔 0.5-2 个细胞），保证单克隆来源。

培养过程中，使用含合适血清或生长因子的培养基，为细胞提供充足营养；定期更换培养液，防止代谢废物积累影响细胞生长。同时，培养环境需保持稳定的温度、湿度和气体浓度（如 37℃、5% CO?），减少外界因素对细胞的干扰。

观察与筛选阶段，需及时标记单克隆细胞孔，避免克隆间相互融合；待克隆生长至合适大小后，挑选形态均一、生长良好的克隆进行扩大培养。此外，设置阴性（未接种细胞孔）和阳性（正常培养细胞孔）对照，排除污染和非特异性生长，多次重复实验以确保单克隆细胞株的纯度和可靠性。