ELISA 检测

应用简介

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。

技术原理

 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强。

实验方法

技术总结

1、可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。

2、包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。

3、对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。

4、用最适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定OD值，选择OD值≥1.0的那个抗原稀释度为最适包被浓度。

5、抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。温度高（如37℃、45℃、或56℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。

ELISA 检测的准确性依赖于严谨的操作和细节把控。实验前，需确保试剂盒在有效期内，提前将试剂平衡至室温，避免因温差导致的检测误差；同时，所有耗材应洁净无酶残留，建议使用一次性吸头防止交叉污染。

加样过程中，需严格控制加样体积和速度，避免产生气泡或液体挂壁，防止样本间的相互干扰；加样后应及时轻拍反应板使液体混合均匀，但不可过于剧烈。温育环节至关重要，需严格按照说明书控制时间与温度，使用恒温箱时避免反应板直接接触箱壁，防止受热不均；若采用水浴，需确保反应板密封，防止液体蒸发影响结果。

洗涤步骤直接影响检测背景，需充分去除未结合物质，但洗涤次数和力度需适中，过度洗涤可能导致抗原 - 抗体复合物解离；底物显色时需避光操作，严格控制显色时间，避免颜色过深超出线性范围；终止反应后，应尽快使用酶标仪读数，防止吸光度值随时间漂移。此外，实验需设置空白对照、阴性对照和阳性对照，确保结果的可靠性。